for
science and
NCAM and Mice and Individuality and
behaviour and ethology and olfactory
memory go to
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CONSEQUENCES OF A DEFICIT OF THE
NEURONAL CELL ADHESION
MOLECULE (NCAM) IN THE
TELENCEPHALON FOR LEARNING,
MEMORY AND INDIVIDUALITY IN A
GENETICALLY MANIPULATED
LABORATORY-MOUSE
Nikolas Fentrop
Dissertation at the department of Biology of the University of Hamburg,
Germany, 2003
German with English summary
Original title: Auswirkungen eines Defizits des Neuronalen
Zelladhäsionsmoleküls (NCAM) im Telencephalon auf Lernen,
Gedächtnis und Individualität bei einer gentechnisch veränderten
Labormaus
English summary
This study could not confirm the hypothesis that NCAM-deficient mice
have a profound deficit
in spatial long-term memory in the Morris water maze - besides some
subtle shortfalls in the
short- and long-term search precision. However, with a unique approach
of a behavioural
analysis to genetically manipulated animals it could be shown that NCAM
knock-out mice
possess a longer-term individual behavioural consistency. This is the
first study to show a
group of "normal" animals (wild-type) to change their individual
behaviour over time while
the knock-out littermates persistently keep their individual
behavioural traits.
Based on the hypothesis that synaptic plasticity underlies learning and
memory it has been hypothesised that the
neuronal cell adhesion molecule (NCAM) could be involved in long-term
memory consolidation, in particular
spatial memory. Sixteen conditional knock-out male mice (ko), and 15
male wild-type litter mates (wt) were
tested in various behavioural paradigms. In the ko-mice a 90 %
reduction of NCAM expression was previously
demonstrated in the hippocampus and to a lesser extend in the neocortex
from post-natal week 3 onwards.
Mice were singly housed under an inverse light cycle and tested in the
dark phase. All animals completed the
following tests successively over 80 days. (I) On day 1 an open-field
test for exploratory activity; (II) on day 3 a
light-dark avoidance test for light-induced, anxiogenic behaviour;
(III) on day 21 to 54 a Morris water-maze
test series (mice must search for a platform hidden under the water
surface using distal optical landmarks); (IV)
on day 76 an open-field test identical to day 1; (V) on day 80 an
open-field test in a circular instead of a square
arena.
No significant differences between ko- and wt-mice were found in
general parameters (e.g. body weight,
frequency of defecation or urin-patches) reflecting their ability to
perform tests of learning and memory or to use
coping strategies. Furthermore, there was no significant difference in
their preference of the dark quadrant in the
light-dark avoidance test, nor in the distribution of activity in
illuminated versus dark zones, which would
indicate differences in anxiogenic behaviour.
Like previous findings in hippocampus-deficient rodents, the locomotor
activity was significantly greater in the
ko-mice than in the wt-mice. In all three open field tests and in the
light-dark avoidance test, the NCAM-
deficient mice covered 36-80 % more distance and visited the different
zones of the arena more frequently.
An analysis of exploratory behaviour in the circular arena showed that
mice of both genotypes made
disproportional use of the arena zones. Thus, during the first five
minutes they covered greater distances in an
area within 10 cm of the wall than in the central areas, an effect,
however, which was not evident in the entire
test time of 20 minutes. Furthermore, half of the time mice spent
moving they did so within the third of the arena
adjacent to the wall.
In all open-field tests, significant differences between genotypes were
found in the relative distribution of
activity in arena zones. In general, ko-mice moved further from the
walls, visited the zones closer to the centre
more often, stayed longer in the intermediate zone, and covered a
greater relative distance (proportion of
distance moved in zone to total distance moved) in the intermediate
zone. Furthermore, ko-mice became active
earlier towards the centre or remained there active for longer periods
of time. In the contrary, all mice were
slowest in the zone adjacent to the wall and increased their speed of
locomotion gradually towards the centre by
about 50%.
Learning and memory performance of mice was studied using three
measures: (1) habituation (2) individual
consistency in behaviour as an expression of a general ability to
encode experience, and (3) memory of spatial
configurations in the Morris water-maze test.
Mice of both genotypes exhibited significant short- (intra-test) and
long-term (inter-test) habituation for the
distance travelled. For travel speed, on the other hand, only
short-term habituation was significant. However, for
none of these variables a significant difference between ko- and
wt-mice was detected.
Individual consistency of behaviour was measured by the individual's
stability of responding to repeated
stimuli, in terms of the rank of the individual's responding within its
own genotype group. For each variable, the
values of all individuals of the same genotype were correlated between
two corresponding tests (Pearson
correlation). In addition, the individual habituation curves were
analysed for consistency.
Short-term consistency: Medium (r >= 0.50) to high (r >= 0.80)
correlations were found within the variables
"distance moved", "speed", and "frequency of visits" both for ko- and
wt-mice if tests were separated by a few
days (open-field tests and light-dark avoidance test: "dry tests") or
up to three weeks (Morris water-maze: "wet
test"). The correlations were independent of the type of test
(open-field tests or light-dark avoidance test),
independent of the kind of arena (circular or square), and independent
of the novelty of the test. However, there
was hardly any correlation between dry and wet tests.
Long-term consistency: Medium to high correlations were obtained for
ko-mice, but not for wt-mice if tests
were separated by ten weeks. The comparison of individual habituation
curves for the two identical open field
tests (separated by 79 days) revealed more shared characteristics
within animals for ko-mice than for wt-mice.
Medium correlations of characteristics could be detected for ko- but
not for wt-mice.
In the Morris water-maze test for spatial memory ko-mice did not differ
significantly from wt-mice in the
learning curve of latency to locate the target platform. However,
during the learning period, ko-mice were
delayed by a few days in swimming close to the platform compared to
wt-mice (approaching significance,
p <0.100). In addition, ko-mice took longer than wt-mice to reach a
smaller platform (diameter 15 instead of
20 cm) on day 3 of testing. Nevertheless, when searching ko- and
wt-mice did not differ significantly in their
exclusive proximity to the former platform position ("exclusive":
compared to three additional, virtual platform
positions) in the probe trials (no platform present) which took place 1
hr and 65 hrs after the last learning trial.
In two further probe trials, 22 days after the last learning trial and
a series of learning trials with a new platform
location, ko-mice did not show any significant spatial preference for
the target area whereas wt-mice at least
preferred the virtual target position compared to a position opposite.
There was no difference between ko- and wt-mice in (1) navigation
strategy or (2) the signals used for
orientation while searching. Mice of both genotypes did not swim to the
switched target position when the distal
optical landmarks where moved 180° to point to the opposite side of the
water maze. Presumably, the moved
landmarks in combination with further uncontrolled landmarks present in
the room where not utilisable for
orientation since they were contradictory. Only when distal optical
landmarks were removed mice of both
genotypes swam in exclusive proximity of the target platform,
apparently using uncontrolled landmarks. Mice of
both genotypes did not swim in exclusive proximity to the target
platform whether in continuous darkness or
when the light was switched off within four seconds from the start.
Latency to reach the platform did not
improve between three learning trials under initial light and
subsequent darkness. It appears that mice depended
on visual landmarks for navigation.
There were no significant differences detected in motivational status,
sensomotor abilities or coping
strategies between ko- and wt-mice (e.g. floating, thigmotaxis or
latency to a visible platform or distance
covered while searching).
In conclusion, this study could not confirm that NCAM-deficient mice
have a profound deficit in long-term
memory, especially in the spatial domain. However, compared to wt-mice,
ko-mice showed (1) subtle shortfalls
in the short- and long-term search precision in the Morris water maze,
(2) altered exploratory behaviour directed
more towards the centre of the arena, and (3) longer-term individual
behavioural consistency.
The finding of short-term behavioural consistency for all mice when
tested in identical or similar, but not in
rather different situations supports the "interactionistic model" of
individuality (Magnusson & Endler 1977,
p. 4). Since wt-mice showed a time-restricted individual behavioural
consistency, one can assume a time-
dependent natural loss of individual consistency. Given that this loss
was smaller in the ko-mice, NCAM seems
to be involved in the development of behavioural individuality in mice
for reactive variables (distance travelled
and speed). This effect could be due to the dependence of behavioural
individuality on learning and memory
processes.
Regarding the role of NCAM, it is possible that ko-mice having a NCAM
deficit also have reduced synaptic
plasticity resulting in a limited ability for behavioural adaptation
(behavioural inflexibility). However, due to the
likelihood of mechanisms compensating for the NCAM deficit, active on
various organismic, integrative levels,
a direct relationship between NCAM and the observed behavioural
deviations compared to wt-mice is unlikely.
In the future cellular mechanisms of long-lasting behavioural
consistency or behavioural inflexibility could be
investigated using conditional NCAM mice.
Keywords: NCAM, mouse, behaviour, learning, memory, consistency,
individuality, Morris water maze, test
battery
Bibliografische Angaben: Fentrop, N. (2003), Auswirkungen eines
Defizits des Neuronalen Zelladhäsionsmoleküls
(NCAM) im Telencephalon auf Lernen, Gedächtnis und Individualität bei
einer
gentechnisch veränderten Labormaus, Litis Press Publishers, München.
*************
Zusammenfassung
Auf der Hypothese aufbauend, daß Lern- und Gedächtnisphänomene auf
Veränderungen der synaptischen
Plastizität basieren, sollte geklärt werden, ob das Neuronale
Zelladhäsionsmolekül (NCAM) an der Bildung von
Langzeit- bzw. räumlichem Gedächtnis beteiligt ist. Für die
Verhaltensuntersuchungen wurde ein gentechnisch
veränderter Mausstamm eingesetzt, dessen konditionale knock-out (ko) -
Mäuse ab der dritten postnatalen Woche
im Telencephalon weniger NCAM exprimierten als die wild-type (wt)
-Kontrollmäuse (nachweislich etwa 90%
Reduktion im Hippokampus und geringere Reduktion im Neokortex).
Die Tiere wurden einzeln unter inversem Lichtrhythmus gehalten und in
der Dunkelphase getestet. Die männlichen
ko-Mäuse (n = 16) und deren männliche wt-Nestgeschwister (n = 15)
durchliefen während eines Zeitraumes von
80 Tagen folgende Testserie: (I) am Tag 1 ein Open field-Test
(Explorationstest), (II) am Tag 3 ein Hell-Dunkel-
Meidetest (Test auf lichtinduziertes "angstähnliches" Verhalten), (III)
vom Tag 21 bis 54 eine Morris water maze-
Testreihe (schwimmende Suche nach einer unter der Wasseroberfläche
verborgenen, ortskonstanten Zielplattform
mit ausschließlich distalen visuellen Landmarken zur Orientierung),
(IV) am Tag 76 ein dem Tag 1 identischer
Open field-Test, und (V) am Tag 80 ein Open field-Test in einer runden
statt quadratischen Arena.
Es konnten keine signifikanten Unterschiede in allgemeinen
Verhaltensparametern zwischen den beiden
Mäusegruppen nachgewiesen werden, die Hinweise auf unterschiedliche
Voraussetzungen für die Bewältigung der
Lern- und Gedächtnistests oder unterschiedliche Verhaltensstrategien
hätten geben können (u.a. Körpergewicht,
Defäkation oder Urinlachen). Ebenso unterschieden sich die ko- und
wt-Mäuse im Hell-Dunkel-Meidetest für
angstähnliches Verhalten nicht signifikant in der vorhandenen Präferenz
des dunklen Quadranten oder in der
Aktivitätsverteilung auf die Hell- und Dunkelzonen.
Die lokomotorische Aktivität der ko-Mäuse war (entsprechend den
Erwartungen aufgrund von Ergebnissen von
Hippokampus-funktionsgestörten Rodentia) in den Open field-Tests und
dem Hell-Dunkel-Meidetest signifikant
höher als die der wt-Mäuse. Sie legten zwischen 36 % und 80 % mehr
Strecke zurück und besuchten die einzelnen
Zonen der Arenen häufiger.
Die Analyse des Explorationsverhaltens ergab, daß die Mäuse beider
Genotypengruppen die runde Arena in den
ersten 5 min nicht flächenproportional abliefen. Sie legten mehr
Strecke auf der max. 5 bis 10 cm von der Wand
entfernten Fläche zurück, was jedoch über eine Expositionszeit von 20
min nicht mehr nachweisbar war. Dagegen
verbrachten die Mäuse in den 20 min die Hälfte der Zeit, in der sie
sich fortbewegten, auf etwa einem Drittel der
randnahen Fläche. Bezüglich der prozentualen Verteilung der Aktivitäten
auf die Zonen der Open field-Testarenen
wurden signifikante Explorationsunterschiede zwischen den ko- und
wt-Mäusen gefunden. Die ko-Mäuse waren im
Vergleich zu den wt-Mäusen in der Regel weiter von der Wand entfernt,
sie besuchten die Zonen zum Zentrum
hin häufiger, hielten sich länger in der Zwischen- als in der Randzone
auf und legten dort mehr relative Strecke
(Verhältnis der Zonen- zur Gesamtstrecke) zurück. Auch waren die
ko-Mäuse im zeitlichen Verlauf der Tests
länger oder früher näher zur Mitte hin aktiv. Dagegen waren alle Mäuse
in der Randzone am langsamsten und
wurden graduell bis ins Zentrum hin rund 50 % schneller.
Die Lern- und Gedächtnisleistungen der Mäuse wurden in drei Komplexen
untersucht: (1)
Habituationsphänomene, (2) individuelle Verhaltenskonsistenz als
Ausdruck von allgemeiner
Erfahrungsspeicherung und (3) Gedächtnis für eine räumliche
Konstellation im Morris water maze-Test.
Die Mäuse habituierten in den drei Open field-Tests sowohl im
Kurzzeitbereich (innerhalb eines Tests) als auch
im Langzeitbereich (zwischen zwei Tests), was sich in der Verringerung
der zurückgelegten Strecke zeigte. Die
Geschwindigkeit verringerten sie signifikant nur im Kurzzeitbereich. In
keiner dieser Variablen ließ sich ein
signifikanter Unterschied zwischen den ko- und wt-Mäusen nachweisen.
Individuelle Konsistenz in Verhaltensweisen wurde als individuell
gleichbleibende Reaktion (nicht absolut,
sondern im Verhältnis zur Reaktion der weiteren Tiere der Gruppe) auf
wiederkehrende Stimuli gemessen. Jeweils
im Vergleich von zwei Tests wurden die individuellen Werte aller Mäuse
pro Variable innerhalb ihres Genotyps
korreliert (Pearson-Korrelation). Ebenso wurden die Habituationskurven
(Kurvenverläufe) auf ihre Konsistenz hin
untersucht.
Im kurzfristigen Bereich korrelierten jeweils die Variablen Strecke und
Geschwindigkeit und die Anzahl der
Besuche bei ko- und wt-Mäusen mittel (r >= 0.50) bis stark (r >=
0.80), wenn die Tests einige Tage (Open field-Test
und Hell-Dunkel-Meidetest = Trockentests), bzw. einige Tage bis zu 3
Wochen (Morris water maze-
Test = Naßtest) auseinander lagen. Die Korrelationen waren unabhängig
vom Testtyp (Open field-Test oder Hell-
Dunkel-Meidetest), unabhängig von der Arenaform (quadratisch oder rund)
und unabhängig von dem
Neuigkeitswert des Tests. Dagegen waren zwischen den beiden Testtypen
Trocken- und Naßtest fast keine
Korrelationen nachzuweisen.
Im längerfristigen Bereich von 10 Wochen blieben die mittleren bis
starken Korrelationen bei den ko-Mäusen
erhalten, nicht aber bei den wt-Mäusen. Die vergleichende Analyse der
individuellen Habituationskurven in zwei
identischen Open field-Tests, die 79 Tage auseinanderlagen, ergaben
größere Übereinstimmungen bei den ko- als
bei den wt-Mäusen und mittlere Korrelationen nur bei den ko-, nicht
aber bei den wt-Mäusen.
Im Morris water maze-Test für räumliches Gedächtnis unterschieden sich
die ko- und wt-Mäuse in der Lernkurve
der Latenz zur Plattform während der Lernphase (nur Lernläufe mit
Plattform) nicht signifikant voneinander.
Dagegen hielten sich die ko-Mäuse während ihrer Plattformsuche
statistisch tendenziell erst einige Tage später
ebenso nah an der Zielplattform auf wie die wt-Mäuse. Als die Plattform
verkleinert wurde, benötigten die ko-
Mäuse mehr Zeit als die wt-Mäuse, um die Plattform zu erreichen. In den
anschließenden Testläufen auf räumliches
Suchverhalten (ohne Plattform) nach einer bzw. 65 Stunden schwammen die
ko- und die wt-Mäuse in exklusiver
räumlicher Nähe zur Zielplattform (exklusiv: im Vergleich zu drei
weiteren rädiärsymetrisch angeordneten
virtuellen Plattformen). In einem weiteren Testlauf nach 22 Tagen
Schwimmpause und ebenso nach einer
Umlernphase auf eine neue Plattformposition war für die ko-Mäuse keine
signifikante räumliche Präferenz mehr
nachzuweisen. Die wt-Mäuse zeigten dagegen eine, wenn auch verminderte,
räumliche Präferenz für die Ziel- im
Vergleich mit der Visavis-Plattform.
Es gab keine Unterschiede zwischen den ko- und wt-Mäusen hinsichtlich
der Navigationsstrategie oder der
genutzten Orientierungshilfen. Die Mäuse beider Gruppen schwammen nach
umgehängten distalen visuellen
Landmarken nicht an den Ort, auf den diese verwiesen. Vermutlich waren
die umgehängten Landmarken in
Kombination mit weiteren im Raum vorhandenen und nicht kontrollierten
konstanten Landmarken von den Mäusen
wegen der widersprüchlichen Ortsweisung nicht nutzbar. Erst als die
distalen visuellen Landmarken entfernt waren,
hielten sie sich in exklusiver räumlicher Nähe zur Zielplattform auf,
nutzten also andere Landmarken. In
unterschiedlichen Läufen ohne oder nur mit anfänglichem Licht schwammen
die Mäuse nicht signifikant in der
Nähe der Plattformposition, und die Latenz zur Plattform verbesserte
sich nicht, was auf die ausschließliche
Nutzung visueller Informationen deutet.
Es konnten keine signifikanten motivationalen oder sensomotorischen
Unterschiede oder Unterschiede in der
Verhaltensstrategie zwischen den ko- und wt-Mäusen nachgewiesen werden
(u.a. Thigmotaxis, Sich-treiben-
lassen, Latenz zur markierten Plattform oder Schwimmstrecke während der
Plattformsuche).
Zusammengefaßt konnte nicht bestätigt werden, daß die NCAM-defizitären
ko-Mäuse ein vor allem im räumlichen
Bereich deutlich eingeschränktes Langzeitgedächtnis haben. Es wurden
jedoch subtile Einschränkungen in der
kurz- und längerfristigen Suchpräzision, ein verändertes, mehr zur
Mitte hin orientiertes Explorationsverhalten und
eine längerfristige Konsistenz in der individuellen Verhaltensanpassung
nachgewiesen.
Die individuelle Verhaltenskonsistenz aller Mäuse in gleichen oder
ähnlichen aber nicht in sehr unterschiedlichen
Testsituationen bestätigt das "Interaktionistische
Individualitätsmodell" (Magnusson & Endler 1977, S. 4). Für die
wt-Mäuse wurde eine zeitlich begrenzte Verhaltenskonsistenz
nachgewiesen, und es kann von einem
zeitabhängigen natürlichen Verlust der Verhaltenskonsistenz ausgegangen
werden. Das Vorhandensein von NCAM
scheint eine Rolle bei der Veränderung der Verhaltensindividualität von
Mäusen in reaktiven Variablen (hier
Strecke und Geschwindigkeit), möglicherweise aufgrund von Lern- und
Gedächtnisdefiziten, zu spielen.
Insgesamt lassen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit vermuten, daß
bei den ko-Mäusen eine von einem NCAM-
Defizit begleitete eingeschränkte synaptische Plastizität vorliegt, die
zu eingeschränkter Verhaltensanpassung
(= Verhaltensstarrheit) führt. Da bei den ko-Mäusen auf
unterschiedlichen organismischen Integrationsebenen
kompensatorische Effekte aufgrund des reduzierten NCAM angenommen
werden müssen, ist keine unmittelbare
Kausalität zwischen NCAM und den Verhaltensabweichungen zu erwarten.
Mit Hilfe des konditionalen NCAM-ko
Mäusestammes ließen sich künftig die zellulären Mechanismen von
langfristiger Verhaltenskonsistenz bzw. -
starrheit näher untersuchen.
Stichwörter: NCAM, Maus, Verhalten, Lernen, Gedächtnis, Konsistenz,
Individualität, Morris water maze,
Testbatterie
*****************
ENTWICKLUNG
EINES OLFAKTORISCHEN GEDÄCHTNISTESTS FÜR LABORMÄUSE
Christina Fentrop
Dissertation an der Universität Hamburg, Deutschland, 2004
A NEW ONE TRIAL OLFACTORY RECOGNITION
TEST FOR LABMICE
Dissertation at the department of Biology of the University of Hamburg,
Germany, 2004 German with English abstract
© Christina Fentrop Email: christina@fentrop.com
Verlag: Litis Press Publishers, München 2004 1. Auflage 11/2004 132
Seiten, 37 s/w Abbildungen, 36 Tabellen Email: info@litispress.com Der
deutschen Verzeichnis Lieferbarer Bücher gemeldet
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vertrieb@LitisPress.com with ISBN 0-9751285-3-1
Abstract
Many animal models in biomedical science are basing on laboratory mice.
Cognitive sciences in recent years make increasing usage of methods
that manipulate the genome of laboratory mice. For example studies on
learning and memory have used knock-out mice, which had genes deleted
that might be involved in memory processes.
Learning and memory tests need to take into consideration the natural
behavioural pre-dispositions of the animal species used. Thus I
designed a memory test which takes into account the natural behaviour
of mice.
(A) Test design
Laboratory C57 mice and Cannabinoid receptor 1-knock-out (CB1-ko) mice
were used in this study. Stressful negative stimuli were strongly
avoided. Because CB1-ko mice have a higher threshold to food
deprivation than their wild type siblings (CB1-wt), food deprivation
and food rewards were not used. The test focused on the natural
tendency of many mammals to inspect thoroughly new objects in their
environment. If the animal is confronted with the same object again,
the time of inspection is significantly shorter. Obviously the animals
had made themselves familiar with objects by investigative be-haviour
and they had stored them in memory as „known“ for some time.
Several points were taken into account in the test design:
• In mice the sense of smell plays a more important role than the sense
of vision espe-cially in social interactions, foraging activities and
anti predator behaviour. Conse-quently, an olfactory memory test was
developed.
• Since animals inspect new objects more intensely in a relaxed
situation, the experi-mental set-up avoided stressful situations.
• Investigations were conducted into whether natural essential oils
were more attrac-tive to mice than monomolecular odours. Because
essential oils were found not to be more attractive, monomolecular
odours were used, which guaranteed a constant quality over time.
• Three odour pairs were chosen. Each consisted of two monomolecular
odours of equal attractiveness: (-)-Carvon / Isoamyl Acetate,
Allylcapronate / Linalool and Anethol / Amyl Propionate.
• Each trial with a given mouse involved a learning period, an
inter-test interval (ITI) and the actual test period. The odours were
presented in a 1.5ml reaction tube. In the learning period two
identical odours were introduced to the mouse. In the test pe-riod the
mouse was confronted with the odour from the preceding learning period
in one tube and an unknown odour in the complementary tube. In
consecutive trials with the same mouse the ITI between learning and
test phase was varied. Thereby a time course of memory performance
could be covered.
• The memory performance was quoted as the index of the relative
inspection dura-tion (RID), which was calculated as the ratio of the
inspection duration of the unfa-miliar odour to the total inspection
duration. If the median of the RID over all mice was significantly
greater than 0.5, then the unfamiliar odour was inspected for longer,
leading to the conclusion that the mice remembered the familiar odour.
Each mouse was tested with each of the three odour pairs and each of
the three ITI´s (sys-tematically varied). In each of the ITI´s there
were test naive mice, mice tested once and mice tested twice.
• As laboratory mice tend to be nocturnal, all tests were carried out
in the dark phase under infrared light.
(B) Test applications
Two memory tests were carried out, each with 18 male C57 mice, and two
further tests each with 9 male CB1-ko and 9 CB1-wt controls.
The results of the memory tests with C57 and CB1-wt mice showed that
the test was well suited to investigate (1) if and for how long
olfactory stimuli could be recalled and (2) whether memory performance
depended on earlier experiences.
CB1-ko mice are known to show a higher and longer freezing reaction to
conditioned aversive stimuli than their CB1-wt siblings. Hence,
extended memory performance was expected.
However, no recognition of the familiar odour could be found in the
CB1-ko mice after any ITI, whereas CB1-wt mice recognized the familiar
odour after 1 h and 72 h.
The inspection duration of the CB1-ko mice was significantly shorter at
any time com-pared to their wt siblings. Furthermore ko mice had a
significant higher level of defeca-tion. Both results lead to the
conclusion that ko mice were more anxious than their wt controls. Ko
and wt mice were in a different physiological state. Hence, the test
results for the CB1-ko mice could not be interpreted clearly.
Tests with C57 and CB1-wt mice showed that the familiar odour was
remembered after 1h, 3h and 72h.
The analysis of the 24 h ITI tests revealed a complex picture. Mice
which were tested naïve at the start of the 24 h memory test remembered
the familiar odour in the test phase, however test-experienced mice did
not.
The lack of olfactory memory found for experienced mice after 24 h can
be interpreted as phasic memory. This "Kamin effect" has also been
discovered in other animal spe-cies and is commonly regarded as an
expression of memory consolidation.
On the contrary to experienced mice, naïve mice memorised the
previously presented odour after 24 hours. This unexpected result is
discussed as suggesting that the consoli-dation of odour memory is
dependent on the significance of the stimulus. For naïve mice their
first odour encounter was impressive enough for the memory to be
consoli-dated and recallable after 24 h. For experienced mice on the
other hand, the learning phase in the 24 h test has been at least their
second encounter with this test situation. It was not as impressive and
therefore, the memory was not yet consolidated and recall-able after 24
h. This interpretation assumes a value dependency of the time course of
memory consolidation: The more significant an encounter (incident) is,
the earlier the consolidation takes place and therefore the earlier the
memory is recallable.
**********
Zusammenfassung
Die Kognitionsforschung bedient sich heute zahlreicher Methoden,
mit denen das Ge-nom der Labormaus gezielt manipuliert werden kann.
Viele Forschungsprojekte befass-ten sich in den letzten Jahren mit
knock-out-Mäusen, bei denen bestimmte Gene, die möglicherweise im
Zusammenhang mit Gedächtnisprozessen stehen, gezielt ausge-schaltet
werden. Nachdem die Genomsequenzen der Maus im Jahre 2000 komplett
ent-schlüsselt wurden, wird die Labormaus auch künftig zu den
wichtigsten Tiermodellen der biomedizinischen Forschung gehören.
Lern- und Gedächtnistests sind nur sinnvoll, wenn sie die natürlichen
Verhaltensdis-positionen jeder einzelnen Versuchstierart
berücksichtigen. Ohne gründliche Tierkennt-nisse führen Verhaltenstests
allzu leicht zu Fehlinterpretationen. Deshalb versuchte ich, einen art-
und verhaltensgerechten Gedächtnistest zu entwickeln, der möglichst
weitge-hend gegen potentielle Fehlerquellen abgesichert werden sollte.
Testentwicklung
Es wurde bewusst auf den Einsatz bestrafender Reize verzichtet, um
übermäßigen Stress zu vermeiden. Da von den hier verwendeten
Cannabinoid-Rezeptor 1 knock-out-Mäusen bekannt war, dass sie eine
höhere Futterdeprivationstoleranz aufweisen als ihre
Wildtyp-Geschwister, wurde auch auf Futterdeprivation und
Futterbelohnungen ver-zichtet. Stattdessen wurde die natürliche Tendenz
vieler Säugetiere genutzt, jedes neue Objekt in ihrer Umwelt ausgiebig
zu inspizieren. Wird dem Tier das gleiche Objekt nach einiger Zeit
erneut präsentiert, verkürzt sich die Inspektionsdauer beträchtlich.
Daraus wird geschlossen, dass die Tiere sich mittels ihres
Inspektionsverhaltens mit den Objekten ihrer Umwelt vertraut gemacht
hatten und diese schließlich als „bekannt“ eine gewisse Zeit lang im
Gedächtnis abspeicherten.
Im einzelnen wurden bei der Entwicklung des Gedächtnistests die
folgenden Punkte berücksichtigt:
• Im Gegensatz zum visuellen Sinneskanal, spielt der Geruchssinn bei
Mäusen eine herausragende Rolle in ihrer komplexen sozialen
Organisation, beim Nahrungser-werb und bei der Feindvermeidung. Deshalb
entschied ich mich für die Entwicklung eines olfaktorischen
Gedächtnistests.
• Da Tiere unbekannte Objekte im „entspannten Feld“ intensiver
erkunden, wurde die Versuchssituation so weit wie möglich stressfrei
gestaltet.
• Es wurde geprüft, ob natürliche ätherische Öle attraktiver sind als
synthetische mo-nomolekulare Duftstoffe. Da dies nicht der Fall war,
wurden künftig nur noch mo-nomolekulare Duftstoffe verwendet, weil nur
diese eine gleich bleibende Duftstoff-qualität garantieren.
Es wurden drei gleichwertige Duftstoffpaare ermittelt, die aus jeweils
zwei mono-molekularen Duftstoffen gleicher Attraktivität bestanden:
(-)-Carvon / Isoamylace-tat, Allylcapronat / Linalool und Anethol /
Amylpropionat.
• Jeder einzelne Test bestand aus einer Lernphase, einem
Intertestintervall (ITI) von 1 h bis maximal 72 h und der eigentlichen
Testphase. In der Lernphase wurden der Maus zwei identische Duftstoffe
in je einem 1,5 ml Reaktionsgefäß geboten. Das ITI wurde variiert, um
herauszufinden, wie lange die Mäuse sich an einen Duftstoff erinnern
können. In der Testphase wurden der Maus zwei verschiedene Duftstoffe
geboten: Einer, der der Maus in der vorhergehenden Lernphase bereits
präsentiert wurde und ein zweiter, ihr nie zuvor präsentierter
Duftstoff.
• Als Maß für das Wiedererkennen des bekannten Duftstoffes wurde die
relative In-spektionsdauer als Index ermittelt, der als Verhältnis der
Inspektionsdauer an dem unbekannten Duftstoff zur
Gesamtinspektionsdauer errechnet wurde. Der Index konnte zwischen 0,0
und 1,0 variieren. War er im Median aller Mäuse signifikant größer als
0,5, wurde der unbekannte Duftstoff länger exploriert. Daraus wurde
ge-schlossen, dass sich die Mäuse an den bekannten Duftstoff erinnerten.
• Jede Maus wurde nacheinander mit jedem der drei Duftstoffpaare und
jedem Inter-testintervall getestet. Die Reihenfolge der Duftstoffpaare
und ITIs wurde systema-tisch variiert. In jedem der ITIs gab es
testnaive, einmal testerfahrene und zweimal testerfahrene Mäuse.
• Da Labormäuse vorzugsweise nachtaktiv sind, wurden alle Tests in der
Dunkelpha-se unter Infrarotlicht durchgeführt.
Testanwendung
Zwei Gedächtnistests wurden mit je 18 männlichen C57-Mäusen
durchgeführt, zwei weitere mit je 9 männlichen Cannabinoid-Rezeptor 1
knock-out-Mäusen (CB1 ko) und je 9 Wildtyp-Geschwistern (CB1 wt) als
Kontrolle. Von den CB1 ko-Mäusen war be-reits bekannt, dass
konditionierte Angstreaktionen langsamer abklingen als bei den CB1
wt-Geschwistern.
In den beiden Tests mit C57-Mäusen und in den Tests mit den CB1
wt-Mäusen wurde übereinstimmend gefunden, dass die bekannten Duftstoffe
nach 1 h bzw. 3 h und 72 h wiedererkannt wurden.
Aus der Auswertung der Inspektionsdaten nach einem 24 h ITI ergab sich
ein differen-zierteres Bild: Nur die testnaiven Mäuse konnten sich nach
24 h an die bekannten Duft-stoffe erinnern. Testerfahrene Mäuse zeigten
dagegen keine Erinnerung nach 24 h.
Im Test mit den CB1 ko-Mäusen konnte dagegen weder nach 1 h, noch nach
24 h und 72 h ein Wiedererkennen des bekannten Duftstoffes nachgewiesen
werden.
Die Ergebnisse der Gedächtnistests mit C57- und CB1 wt-Mäusen zeigen,
dass der Test gut geeignet ist, zu prüfen, ob und wie lange Erfahrungen
mit Geruchsreizen im Gehirn abgerufen werden können und ob dieses
Erinnerungsvermögen von Vorerfahrungen abhängig ist. Die Ergebnisse
konnten in wiederholten Tests reproduziert werden.
Die ko-Mäuse zeigten im Vergleich zu ihren wt-Geschwistern immer eine
signifikant geringere Inspektionsdauer und zugleich eine signifikant
vermehrte Ausscheidung von Feces. Daraus kann geschlossen werden, dass
sie ängstlicher sind als die wt-Kontrolltiere. Somit befanden sich die
ko-Mäuse in einem anderen Grundzustand als die wt-Kontrolltiere. Daher
führte der olfaktorische Gedächtnistest mit den von mir ver-wendeten
CB1 ko-Mäusen zu keinem eindeutig interpretierbaren Ergebnis.
Die fehlende Nachweisbarkeit des olfaktorischen Gedächtnisses für
testerfahrende Mäuse nach 24 h spricht für ein phasisch auftretendes
Gedächtnis, das auch bei anderen Tierarten gefunden worden ist. Dieser
sogenannte Kamin-Effekt wird heute allgemein als Ausdruck von
Gedächtniskonsolidierungsprozessen interpretiert. Dagegen konnten sich
testnaive Mäuse auch nach 24 h an einen zuvor präsentierten Duftstoff
erinnern. Dieses unerwartete Ergebnis wird in der Richtung diskutiert,
dass es von der Wertigkeit des Stimulus abhängt, wann die
Konsolidierung der Duftstoffreize stattfindet. Für eine testnaive Maus
war die erste Begegnung mit den Duftstoffen in der Lernphase
höher-wertig, so dass die Erinnerung nach 24 h bereits konsolidiert und
abrufbar war. Für eine testerfahrene Maus war dagegen die Lernphase vor
dem 24 h ITI bereits die wiederholte Begegnung mit der Testsituation.
Die Begegnung war geringerwertig und deshalb war die Erinnerung nach 24
h noch nicht konsolidiert bzw. abrufbar. Diese Interpretation
unterstellt einen Anpassungswert des Zeitpunktes einer
Gedächtniskonsolidierung: je höherwertig eine Begegnung (Ereignis) ist,
umso früher findet die Konsolidierung statt und damit ist das
Gedächtnis früher abrufbar.
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